qPCR: zur Quantifizierung der DNA-Menge in Proben

Die Polymerase-Kettenreaktion und die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) sind zwei wichtige Methoden bzw. Technologien der Molekularbiologie und Diagnostik, die zur Amplifikation von DNA und RNA/cDNA genutzt werden. Wo die Unterschiede zwischen beiden Technologien liegen und welche Vorteile die qPCR im Vergleich zur PCR bietet und vieles mehr zu diesem Thema erfahren Sie in diesem Beitrag. Zusätzlich stellen wir Ihnen kurz Lösungen von Roche vor, mit denen Sie in Ihrem Labor qPCR-Tests schnell, prozesssicher und mit aussagekräftigen Ergebnissen durchführen können. Interessiert?

Unter PCR versteht man die Abkürzung des Fachbegriffs “Polymerase Chain Reaction” (Poymerase-Kettenreaktion). Genauer gesagt, handelt es sich um ein bewährtes Verfahren zum Nachweis beziehungsweise zur Qualifizierung von spezifischen Gensequenzen, die zum Beispiel bei Virusinfektionen sowie Erbkrankheiten auftreten können. So werden PCR-Tests unter anderem dazu genutzt, um (gespendetes) Blut auf HIV oder Hepatitis hin zu untersuchen.

Prinzipiell funktioniert ein PCR-Test wie folgt: Mithilfe der PCR werden DNA-Sequenzen mittels wiederholtem Erhitzen und anschließender wiederholter Sequenzvervollständigung sowie Abkühlen schnell und in großen Mengen reproduziert. So kann man sogar aus winzig kleinen Erbgutmengen ausreichend Material für genetische Tests generieren. Mehr zum Thema PCR-Tests erfahren Sie

hier .

Was versteht man unter qPCR?

Die Abkürzung "qPCR" steht für quantitative Polymerase-Kettenreaktion. Hierbei handelt es sich um eine Methode der Molekularbiologie, die man verwendet, um die Menge an DNA (oder RNA) in einer Probe messen zu können. Die qPCR basiert auf der herkömmlichen PCR. Die PCR-Methode dient der Vervielfältigung der Menge an spezifischer DNA in einer Probe. Bei der qPCR hingegen kann zusätzlich die Menge der vervielfältigten DNA in Echtzeit gemessen werden. Darum nennt man diese Methode auch Realtime-PCR beziehungsweise Echtzeit-PCR.

Grundsätzlich unterscheidet man zwischen zwei qPCR Ansätzen: Einerseits gibt es Methoden, welche auf dem Einbau von Fluoreszenz-Farbstoffen in doppelsträngige DNA beruhen. Diese bezeichnet man als farbstoffbasierte qPCR. Andererseits existieren Methoden, bei denen man Fluoreszenz-markierte DNA-Sonden einsetzt. Hier spricht man von sondenbasierter qPCR.

Bei dieser Methode wird ein spezieller Fluoreszenz-Farbstoff in die PCR-Lösung eingegeben, der sich an die produzierte DNA bindet und bei Anwendung von Licht fluoresziert. Die Intensität der fluoreszierenden Reaktion steigt während des Vorgangs der Amplifikation, weil die Menge des vervielfältigten DNA-Materials ebenfalls ansteigt.

Das Messen der fluoreszierenden Reaktion erfolgt während der PCR in regelmäßigen Zeitintervallen und ermöglicht so eine Quantifizierung der DNA-Menge. Die farbstoffbasierte Real-Time PCR stellt einen schnellen und kostengünstigen Weg dar, um eine große Anzahl von Proben zu untersuchen.

Die sondenbasierte qPCR verwendet eine spezielle Sonde, die sich während der PCR-Reaktion auf die Ziel-DNA bindet. Diese spezielle Sonde ist markiert und fluoresziert, wenn sie mit der Ziel-DNA in Kontakt kommt. Die Menge der markierten Sonde, welche an die Ziel-DNA gebunden ist, nimmt während des Prozesses der Amplifikation zu, wobei die Messung des Fluoreszenzsignals in Echtzeit erfolgt.

Da die sondenbasierte qPCR typischerweise spezifischer als die farbstoffbasierte ist, wird diese Methode häufiger bei diagnostischen Anwendungen eingesetzt. Sie ist aber im Vergleich zur farbstoffbasierten Methode aufwändiger und in den meisten Fällen auch teurer.

  • Farbstoffbasierte qPCR
  • Sondenbasierte qPCR

Real-time PCR (qPCR)

Zum Quantifizieren von Genabschnitten oder Transkripten nutzt man häufig Geräte, wie zum Beispiel sogenannte LightCycler® Systeme. In einem LightCycler® System erfolgt die Detektion von PCR-Produkten über Fluoreszenzsignale. Diese sind entweder sequenzunspezifisch oder mittels fluoreszenzmarkierter Sonden sequenzspezifisch.

Zum Zweck einer sequenzspezifischen Detektion setzt man Sonden ein, die zu einer spezifischen Sequenz der zu analysierenden DNA komplementär sind und sich während der PCR an die amplifizierte DNA binden. Binden die Sonden an die DNA, löst dies eine Fluoreszenz aus, die von einem Detektor erfasst wird. Um die Menge der amplifizierten DNA zu bestimmen, misst man während der PCR die Intensivität der Fluoreszenz. Das Ansteigen der Stärke des Fluoreszenzsignals ist proportional zur Menge der entstehenden DNA. Diese kann in Echtzeit verfolgt werden.

So kann man mittels qPCR beispielsweise chromosomale Fusionsgene beziehungsweise deren Transkripte analysieren, welche bei vielen Leukämie- und Lymphomformen entstehen. Und dies spielt beim Monitoring der Erkrankung eine wichtige Rolle.

Anwendungsbereiche von qPCR Assays

Für bestimmte Anwendungsbereiche wie zum Beispiel MRSA, STI, HPV und Stoffwechselerkrankungen reicht der qualitative Nachweis von Nukleinsäuren aus. Für andere, wie zum Beispiel in der Genexpressionsanalyse und beim Nachweis von gentechnisch veränderten Organismen in Lebensmitteln sowie bei der Therapie von unter anderem HIV oder nach Organtransplantationen ist eine quantitative Analyse erforderlich. Die qPCR kann man sowohl für die qualitative als auch für die quantitative Analyse verwenden.

qPCR Assays

  • zählen heute als das Maß aller Dinge, wenn es darum geht, Nukleinsäuren in unterschiedlichen biologischen Proben auf schnelle Weise zu bestimmen und zu quantifizieren.

  • werden in Forschungslabors oft zur quantitativen Messung der Gendosierung in transformierten Zelllinien genutzt. Oder auch zum Nachweis von mutierten Genen eingesetzt.

  • können auch In Kombination mit der RT-qPCR (RT = Reverse Transkription) dazu verwendet werden, um Veränderungen in der Genexpression exakt zu quantifizieren. Wie zum Beispiel eine Ab- oder Zunahme der Expression als Reaktion auf verschiedene Umweltbedingungen.

Über PCR: Wissenswertes in Kürze (1)

Bei der LightCycler® System-Technologie handelt es sich um eine der am häufigsten verwendeten Methode für die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR). Sie nutzt eine Vielzahl an Fluoreszenzfarbstoffen, um einerseits den Fortschritt der Amplifikation in Echtzeit zu überwachen und andererseits um die Menge der DNA in einer Probe exakt zu bestimmen.

Ein LightCyler® System besteht aus einem thermischen Cycler, einem Detektionsgerät und speziellen Reagenzien. Der Cycler ermöglicht die Kontrolle der Temperaturbedingungen während des Amplfikationsprozesses. Das Detektionsgerät hingegen überwacht in Echtzeit den Fortschritt der Amplifikation. Und die speziellen Reagenzien dienen dazu, die Amplifikation und Quantifizierung der DNA in der Probe zu ermöglichen.

Ein großer Vorteil der LightCycler® System-Technologie besteht in ihrer Geschwindigkeit: Sie macht es möglich, eine qPCR-Analyse in weniger als einer Stunde durchzuführen. Darüber hinaus bietet sie eine hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit.

Zusätzlich kann man LightCycler® Systeme für die Analyse von verschiedenen Arten von DNA-Proben einsetzen, wie zum Beispiel Genexpression, RNA und Mutationserkennung. Und sie ist in der Lage, die Amplifikation mehrerer Ziel-DNA-Regionen gleichzeitig zu überwachen, was zu einer erheblichen Steigerung der Durchsatzrate und Effizienz führt.

LightCycler® Systeme von Roche

Mit dem

LightCycler® 480 System (RUO*) und dem LightCycler® 96 System (RUO*) bietet Roche zwei Geräte, die für überragende Hard- und Software für alle Anwendungen in der qPCR stehen - egal ob in der Diagnostik oder Forschung, ob relative oder absolute Quantifizierung oder Genotypisierung und Gene Scanning.

  • Leistungsstarke Hardware

  • Innovative Software

  • Speziell entwickelte Einwegprodukte

  • Anwendungsoptimierte Reagenzien für eine Vielzahl von Experimenten

  • Intuitive, moderne und lizenzfreie Software

  • Touchscreen

  • Durchlaufzeit von weniger als einer Stunde

  • Anwendungen: Absolute und relative Quantifizierung, Endpunkt-Genotypisierung, Schmelzkurvenanalyse, hochauflösendes Schmelzen

* Research Use Only

MagNa Pure Systeme

MagNa Pure Systeme von Roche bewähren sich seit langem bei der reproduzierbaren und sicheren Aufreinigung von qualitativ hochwertigen Nukleinsäuren. Sie eignen sich hervorragend zur Probenvorbereitung in molekularbiologisch ausgerichteten Labore. Aktuell stehen Ihnen zwei

MagNa Pure Systeme zur Verfügung.

Die LightCycler® System-Technologie

LightCycler® PRO System (IVDR/RUO)

  • Größere Flexibilität und Vielseitigkeit mit dualen IVDR1- und RUO2-Modus-Funktionen

  • Verbesserte Temperaturhomogenität

  • Bidirektionale Anbindung

  • Kein Wartungsaufwand und Remote-Zugriff per PC / Smartphone / Tablet

  • Einfache Bedienbarkeit durch 40 cm Touchscreen-Display

Erfahren Sie mehr über das LightCycler® PRO System

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Referenzen

  1. https://www.zusammengegencorona.de/testen/was-sie-zu-pcr-tests-wissen-muessen/


LIGHTCYCLER ist eine Marke von Roche.

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